Badania enzymatycznej degradacji struktury polisacharydów ściany komórkowej owoców przy pomocy mikroskopu sił atomowych (AFM)

Tytuł: Badania enzymatycznej degradacji struktury polisacharydów ściany komórkowej owoców przy pomocy mikroskopu sił atomowych (AFM)

2011/01/B/NZ9/00787

Kierownik: Artur Zdunek

Okres: 2011-2015

Typ projektu i finansowanie: Narodowe Centrum Nauki

Celem naukowym projektu jest poznanie zmian struktury polisacharydów ścian komórkowych oraz struktury i właściwości mechanicznych ścian komórkowych owoców w wyniku enzymatycznej degradacji. W badaniach wykorzystany zostanie mikroskop sił atomowych (AFM) dający możliwość obrazowania i badania właściwości mechanicznych materiałów biologicznych w skali nano. Wynikiem końcowym projektu będzie opis zmian strukturalnych izolatów: celulozy, pektyn i hemiceluloz oraz ścian komórkowych (kompleksów tych polimerów) w wyniku działania następujących enzymów aktywnych w fazie dojrzewania owoców: liaza pektynowa (PL), poligarakturonaza (PG), pektynometyloesteraza (PME), endo (1-4) β-D-glukanaza oraz endotransglikozylaza ksyloglukanu (XET). Innym wynikiem będzie wiedza na temat zmian właściwości mechanicznych ściany komórkowej w wyniku aktywności powyższych enzymów.

Model pierwotnej ściany komórkowej (typu I) jest zbudowany z polisacharydów (celulozy, hemiceluloz, pektyn) oraz z białek strukturalnych. Właściwości wymienionych polisacharydów oraz rodzaj oddziaływania między nimi determinują fizyko-chemiczne cechy całej ściany komórkowej, w tym jej właściwości mechaniczne. Ściany komórkowe owoców podczas wzrostu i dojrzewania podlegają ciągłym zmianom regulowanych działaniem określonych enzymów. W ogólności enzymy te powodują zaprogramowane miękniecie owocu w czasie dojrzewania, co jest obserwowane jako spadek jędrności, pogorszenie tekstury, itp. Z punktu widzenia konsumenta, przechowalni lub przetwórcy, jest to zjawisko niepożądane jeżeli następuje zbyt szybko.

Poznanie enzymatycznych zmian struktury polisacharydów ścian komórkowych oraz właściwości mechanicznych samej ściany komórkowej, podjęty w niniejszym projekcie, ma ogromne znaczenie w wyjaśnieniu mechanizmów powodujących zmiany właściwości owoców podczas dojrzewania, a szczególnie roli poszczególnych enzymów w tym procesie. Wiedza ta i opracowana metodyka w projekcie umożliwi dalsze badania uwzględniające np. czynniki genetyczne, uprawowe, przechowalnicze, itp., a w konsekwencji przyczyni się do optymalizacji produkcji, przechowywania oraz obróbki owoców. Badania zaplanowane w projekcie, pozwolą również uporządkować często sprzeczne doniesienia o roli poszczególnych enzymów w teksturze owoców oraz uzupełnią już istniejącą wiedzę.

Zazwyczaj polimery ścian komórkowych bada się stosując selektywną ekstrakcję. Wyizolowane frakcje polisacharydów ścian komórkowych bada się metodami chemicznymi lub barwieniem w celu obrazowania poszczególnych makromolekuł i uzyskania informacji o ich zawartości oraz lokacji. Dodatkowo takie techniki obrazowania jak SEM i FTIR mogą być użyte. Podstawowym narzędziem w niniejszym projekcie będzie mikroskop sił atomowych (AFM), który od lat 90-tych dostarcza wiele nowych informacji o strukturze i oddziaływaniach na poziomie molekularnym materiałów biologicznych. Jednak jest to ciągle narzędzie nowe, a liczba publikacji z wykorzystaniem AFM do badania owoców jest niewielka. Z tego punktu widzenia projekt ma również znaczenie dla dalszego rozwoju techniki AFM do badania materiałów biologicznych.

Zasada działania mikroskopu sil atomowych (AFM) oparta jest na pomiarze oddziaływań między ostrzem o promieniu krzywizny rzędu kilku nanometrów, a powierzchnią próbki. Ostrze umieszczone jest na dźwigni o znanym współczynniku sprężystości, która wygina się jeśli nastąpiła zmiana profilu powierzchni lub ostrze natrafiło na lokalną zmianę właściwość powierzchni. Dostępne komercyjnie ostrza AFM powalają obecnie uzyskać rozdzielczości rzędu nanometrów. Wykazano, że rozdzielczość ta jest odpowiednia do obrazowania pojedynczych polisacharydów. Jedną z głównych zalet AFM jest możliwość badania próbek zarówno w powietrzu jak i w cieczy, a więc w środowisku zbliżonym do naturalnego. Najczęściej możliwe jest również badanie próbek bez preparatyki, praktycznie w stanie naturalnym. Dodatkowo, AFM umożliwia analizę właściwości mechanicznych powierzchni w każdym punkcie obrazu (z rozdzielczością nm), takich jak: adhezja, lepkość, moduł sprężystości. Często stosowanym modem pracy AFM jest również spektroskopia sił, która polega na rozciąganiu próbki między podłożem a ostrzem, co umożliwia badanie np. konformacji makromolekuły lub siły poszczególnych wiązań na podstawie uzyskanych zależności siła-odległość ostrza od próbki. W badaniach żywność AFM jest stosowany głównie do badania struktury polimerów i ich zmian w wyniku procesów technologicznych, gdzie uzyskuje się informacje niedostane przy pomocy innych dotychczasowych metod. AFM był  stosowany do badania polisacharydów (głównie struktury pektyn i celulozy) z owoców z uwzględnieniem przede wszystkim czynników związanych z przechowywaniem lub efektem jonów wapnia. Technika ta wydaje się szczególnie przydatna do analizy struktury polisacharydów ścian komórkowych oraz struktur z nich zbudowanych pod kątem wpływu na mięknięcie owoców, ponieważ AFM daje bezpośrednią informację o strukturze i mechanice próbki. Jednak można stwierdzić, że wykorzystanie AFM w tej kwestii jest dopiero w początkowym etapie. Jak dotychczas brak jest badań, które w sposób bezpośredni pokazały enzymatyczną degradację struktury polisacharydów ścian komórkowych lub samej ściany komórkowej owoców. Niniejszy projekt podejmuje to zagadnienie. 

Badania w projekcie będą przeprowadzone z użyciem jabłek i gruszek z powodu ich ekonomicznego znaczenia w Polsce i Europie oraz ze względu na wyraźne mięknięcie podczas przechowywania przy relatywnie wysokiej jędrności początkowej.

Badanie przeprowadzone będą w następujących etapach:.

• Dostosowanie (standaryzacja) protokołów ekstrakcji selektywnej poszczególnych polisacharydów: pektyny rozpuszczalne w wodzie, pektyny rozpuszczalne w chelatorze oraz pektyny rozpuszczalne w węglanie sodu, hemicelulozy oraz celuloza wraz z ich analizami biochemicznymi.
• Opracowanie  protokołów obrazowania AFM poszczególnych frakcji polisacharydów owoców i warzyw.
• Opracowanie protokołów analizy obrazów do ilościowej analizy topografii obrazów AFM.
• Opracowanie protokołów pomiarów właściwości mechanicznych ścian komórkowych przy pomocy AFM.
• Analiza AFM in vitro zmian strukturalnych i mechanicznych ścian komórkowych w wyniku kontrolowanej aktywności poszczególnych enzymów.
• Analiza AFM in vitro zmian strukturalnych poszczególnych polisacharydów w wyniku kontrolowanej aktywności poszczególnych enzymów.
• Analiza AFM struktury i właściwości mechanicznych ścian komórkowych z owoców w różnych stadiach dojrzałości przed- i pozbiorczej.
• Analiza AFM struktury poszczególnych polisacharydów ekstrahowanych z owoców w różnych stadiach dojrzałości przed- i pozbiorczej.

Powyższe badania będą uzupełnione oznaczeniami ogólnej aktywności enzymatycznej owoców oraz podstawowymi oznaczeniami stopnia dojrzałości (jędrność, zawartość skrobi, zawartość cukrów, kwasowość oraz analizą sensoryczną (tylko dla owoców dojrzałych)). Porównanie wyników umożliwi powiązanie dynamiki dojrzewania, w tym mięknięcia owoców, ze zmianami strukturalnymi w ścianach komórkowych.

Publikacje

1. Kozioł A., Cybulska J., Pieczywek P.M., Zdunek A., 2015. Evaluation of Structure and Assembly of Xyloglucan from Tamarind Seed (Tamarindus indica L.) with Atomic Force Microscopy, Food Biophysics, DOI 10.1007/s11483-015-9395-2
2. Zdunek A., Kozioł A., Pieczywek P.M., Cybulska J. 2014. Evaluation of the Nanostructure of Pectin, Hemicellulose and Cellulose in the Cell Walls of Pears of Different Texture and Firmness. Food and Bioprocess Technology, 7, 12, 3525-3535.  http://dx.doi.org/10.1007/s11947-014-1365-z
3. Zdunek A., Kurenda A., 2013. Determination of the Elastic Properties of Tomato Fruit Cells with an Atomic Force Microscope. Sensors, 13, 12175-12191. link
4. Cybulska J., Zdunek A. , Kozioł A. 2015. The self-assembled network and physiological degradation of pectins in carrot cell walls, Food Hydrocolloids, 43, 41–50. http://dx.doi.org/10.1016/j.foodhyd.2014.04.032.