Kierownik: dr Monika Szymańska-Chargot

Zespół: mgr Monika Chylińska, dr inż. Piotr M. Pieczywek, mgr Luiza Wątróbka, dr hab. Artur Zdunek

Celem realizacji zadania jest określenie zmian zawartości i lokalizacji polisacharydów w ścianie komórkowej tkanki owocu pomidora (Lycopersicon esculentum Mill.) podczas jego rozwoju przy pomocy obrazowania ramanowskiego. Cel ten związany jest z postawioną hipotezą badawczą, która mówi, że skład chemiczny ścian komórkowych oraz rozmieszczenie przestrzenne substancji budulcowych zmienia się podczas wzrostu owoców i warzyw, co ma wpływ na integralność ścian komórkowych.


Do lokalizacji polisacharydów ściany komórkowej owoców i warzyw najczęściej stosowaną metodą jest obrazowanie z wykorzystaniem przeciwciał. Metody immunocytochemiczne polegają na wykrywaniu i lokalizacji składników komórek i tkanek w oparciu o specyficzną reakcję wiązania antygen-przeciwciało. Antygenami mogą być przede wszystkim białka, ale również polisacharydy i kwasy nukleinowe. Uwidocznienie miejsca wiązania się przeciwciała z antygenem zlokalizowanym w komórce czy tkance możliwe jest jedynie pod warunkiem odpowiedniego znakowania. Metody te są niezwykle czasochłonne, dość drogie oraz selektywne.
Natomiast mapowanie ramanowskie może stanowić dla nich alternatywę, jako metoda niewymagająca skomplikowanego przygotowania tkanki do badań, wymagająca mniej odczynników chemicznych, co jest istotne biorąc pod uwagę aspekty zarówno ekologiczne, jak i ekonomiczne. Jest to również metoda dająca informacje spektralne na temat wszystkich składników próbki jednocześnie.
Mapowanie ramanowskie jest jedną z najbardziej rozwijanych w ostatnich latach technik spektroskopii Ramana. Metoda ta polega na zbieraniu widma Ramana w wielu, przestrzennie rozdzielonych punktach na powierzchni próbki. W wyniku, czego otrzymujemy tzw. obraz chemiczny, a jego analizę możemy przeprowadzić poprzez wybór odpowiednich pasm odpowiedzialnych za określone drgania. Dzięki czemu otrzymujemy informacje na temat rozmieszczenia związków chemicznych na powierzchni skanowanego materiału.

Uzyskane podczas realizacji zadania mapy ramanowskie posłużą do zbadania przestrzennego rozlokowania substancji budulcowych roślinnych ścian komórkowych widocznych na obrazach mikroskopowych. Zestawienie wyników uzyskanych przy pomocy mikrospektroskopu ramanowskiego i mikroskopu konfokalnego (immunocytochemia) oraz analiz chemicznych i widm podczerwieni pozwoli zdobyć informacje na temat realnych zmian polisacharydów (ich ilości oraz rozmieszczenia) zachodzących podczas wzrostu i dojrzewania w ścianach komórkowych pomidora. Dodatkowo metoda obrazowania ramanowskiego zostanie zwalidowana metodą znakowania przeciwciałami w przypadku lokalizacji pektyn.



Referencje:

1. Chylińska M, Szymańska-Chargot M, Zdunek A (2014) Imaging of polysaccharides in the tomato cell wall with Raman microspectroscopy. Plant Meth 10: 14.
2. Gierlinger N, Keplinger T, Harrington M (2012) Imaging of plan cell walls by confocal Raman microscopy. Nat Protoc 7:1694-1708.
3. Qin J, Chao K, Kim MS (2011) Investigation of Raman chemical imaging for detection of lycopen changes in tomatoes during postharvest ripening. J Food Eng 107: 277-288.
4. Richter S, Mussig J, Gierlinger N (2011) Functional plant cell wall design revealed by the Raman imaging approach. Planta 233:768–772.
5. Szymańska-Chargot M, Zdunek A (2013) Use of FT-IR Spectra and PCA to the Bulk Characterization of Cell Wall Residues of Fruits and Vegetables Along a Fraction Process. Food Bioph 8: 29-42.
6. Szymańska-Chargot M, Chylińska M, Kruk,B, Zdunek A (2015) Combining FT-IR spectroscopy and multivariate analysis for qualitative and quantitative analysis of the cell wall composition changes during apples development. Carbohydr Pol 115: 93-103.
7. Szymańska-Chargot M., Pieczywek P. M., Chylińska M.,  Zdunek A. (2016a) Hyperspectral image analysis of Raman maps of plant cell walls for blind spectra characterization by nonnegative matrix factorization algorithm. Chemometr Intell Lab 151:136-145
8. Szymańska-Chargot M., Chylińska M., Pieczywek P. M., Rösch P., Schmitt M., Popp J.,  Zdunek A. (2016b) Raman imaging of changes in the polysaccharides distribution in the cell wall during apple fruit development and senescence. Planta (2016b), DOI:10.1007/s00425-015-2456-4